1938年2月，红二十八军与豫南游击队共3000多人编入新四军第四支队，高敬亭任司令员，相当于师长，与陈毅、张鼎臣、张云逸等支队司令，不光是延安党中央批准，也都是经时任国民政府军事委员会的蒋委员长任命的，是名符其实的将军！新四军第四支队下辖4个团，占当时新四军总兵力的三分之一强。
同年3月8日，四支队奉命从湖北黄安七里坪、河南确山竹沟出发东进抗日，中旬集结安徽霍山以西。休整后继续东进，4月底到达抗日前线舒城、桐城、庐江、巢县、无为等地展开游击战争。
正当高敬亭领导的新四军第四支队在抗日前线取得节节胜利和不断发展的时候，高敬亭与王明领导的中共中央长江局、中共安徽省工作委员会之间在建立大别山根据地问题上产生了意见分歧。在长江局的一次会议上，王明、项英斥责高敬亭在大别山建立根据地是“不服从统一战线、消极抗日”，“不许在大别山留一兵一卒”。高敬亭当场指责王明、项英是“右倾投降主义”者，双方闹翻了脸。意识到大别山军事重要性的桂系将领白崇禧，命令第五路军开进大别山。王明等高喊着“一切服从统一战线，一切经过统一战线”的口号，帮助五路军在大别山建立根据地。
1939年初，桂系在大别山站稳了脚跟，一面拖欠、克扣四支队薪饷，限制其发展；一面扩大反动武装与新四军争夺皖东，四支队陷入桂系和日军的夹击中。
此时，延安中共中央电示中原局书记刘少奇：“江北新四军向津浦路东敌后挺进。”可是，因为有了与王明、项英的不愉快，高敬亭思想有点僵化了。他不积极服从中央、新四军军部向东挺进敌后开辟根据地的指示，抱住大别山不放，因为他觉得前段时间王明等也是口口声声代表中央，事实证明他们盲从统一战线的方针是不正确的。
当初，高敬亭立足于战士土生土长，群众基础好，在地处中原、南濒长江、北临淮河，兵家必争的大别山建立根据地是正确的，然而此时形势已发生了变化。
1938年以来，中央从延安、长江局、八路军武汉办事处等陆续派干部来四支队工作，协调高敬亭与新四军军部和中央的关系。高敬亭对此很有抵触情绪，尤其对派任四支队政治部主任的戴季英(在鄂豫皖苏区与高敬亭共过事)更甚。他认为戴季英是中央派来监视他的，想方设法排斥。
他对第七团正副团长杨克志、曹玉福说：这批人是来夺权的！你们遇事还是同我商量商量。切莫上他们的当。而毫不退让的戴季英不甘示弱，暗中和高敬亭较起劲来，高敬亭则胸有成竹。
1938年11月，新四军参谋长张云逸率军部特务营抵江北，根据中央指示对高敬亭耐心教育，直接向四支队干部传达中央关于江北新四军向津浦路东敌后挺进的指示后，高敬亭勉强率部由舒城推进，于1939年3月抵达合肥众兴集。不久，他借故有病带回手枪连和特务连。4月底，叶挺携邓子恢、罗炳辉、赖传珠等抵江北。5月5日叶挺在庐江东汤池宣布：由张云逸任指挥、邓子恢为政治部主任的新四军江北指挥部成立，统一指挥江北部队作战，再次命令高敬亭部东进合肥、定远、全椒地区开辟根据地。高敬亭接令后按兵不动。叶挺以江北指挥部名义直接命令四支队第七、第八团东进，高敬亭不得不率队跟进。四支队到达合肥青龙场，叶挺在连以上干部会上重申中央东进命令，全体干部举手赞成执行中央指示。高敬亭被迫同意东进。会后，他迟迟不下达东进命令，部队行动后擅自写信命令第七、第八团停止东进。此刻，高敬亭一手提拔的第七团正副团长杨克志、曹玉福侵吞金银财物后叛投桂系，激起四支队上下对高敬亭的强烈不满。这时。中共中央东南局书记、新四军政委兼副军长项英发动“反杨、曹斗争”，与高敬亭积怨很深的戴季英主持这场“斗争”，把高敬亭“居功自傲”、“山头主义”等问题端出来，项英当机立断把“反杨、曹斗争”转为“反高敬亭斗争”，逮捕了高敬亭之后，“反革命”、“反党”、“破坏抗日”等政治罪名接踵而至。